Resumen
El trastorno del espectro autista es un trastorno de origen
desconocido que afecta al desarrollo neurológico. Se ha sugerido que
puede tener un origen genético o debido a factores ambientales,
incluyendo en estos la presencia de sustancias tóxicas en el
ambiente. La exposición humana a la toxina ambiental que es el
aluminio, se ha relacionado, aunque como una mera tentativa, con el
trastorno del espectro autista. Hemos utilizado la técnica de
espectrometría de absorción atómica con horno de grafito calentado
transversalmente para medir, por primera vez, el contenido de
aluminio del tejido cerebral de los donantes que han sido
diagnosticados de autismo. También hemos utilizado flúor
selectivo de aluminio para identificar el aluminio del tejido
cerebral mediante microscopía de fluorescencia. El contenido en
aluminio del tejido cerebral en los autistas era considerablemente
alto. El contenido medio (desviación estándar) de aluminio en
los 5 individuos estudiados para cada lóbulo cerebral fue de 3,83
(5,42), 2,30 (2,00),
2,79 (4,05) y 3,82 (5,17) μg/g
de
peso seco, para los lóbulos occipital, frontal, temporal y parietal
respectivamente. Estos son los valores más altos registrados hasta
ahora en el tejido cerebral humano, y hay que preguntarse por qué,
por ejemplo, el contenido de aluminio en el lóbulo occipital de un
muchacho de 15 años era de 8,79 μg/g de peso seco. Se utilizó
microscopía de fluorescencia selectiva de aluminio para identificar
el aluminio en
el tejido cerebral de 10 donantes. Mientras que el aluminio se
pensaba que estaría asociado a las neuronas, estaba presente en los
espacios intracelulares de células similares a la microglía y otras
células inflamatorias no neuronales de las meninges, vasos
sanguíneos, materia gris y blanca. El
predominio de aluminio en los espacios intracelulares asociados con
células no neuronales fue una
observación
destacada en el tejido cerebral de los pacientes autistas y puede
ofrecer una pista
sobre el origen del aluminio en el tejido cerebral, así como el
papel que puede jugar en la aparición del trastorno del espectro
autista.
1.-
Introducción
El
trastorno del espectro autista (TEA) es un grupo de afecciones de
origen desconocido que
afectan al neurodesarrollo. Es probable que influyan tanto factores
genéticos [1] como ambientales [2] en el inicio y progreso del
trastorno del espectro autista, mientras que se supone que
los
mecanismos subyacentes a su etiología sean multifactoriales [3, 6].
La
exposición humana al aluminio se ha relacionado con el trastorno del
espectro autista, con unas conclusiones erróneas [7-10]. Hasta la
fecha, la mayoría de los estudios han utilizado el pelo como
indicador de la exposición humana al aluminio, mientras que la
presencia de aluminio en la sangre y la orina también se ha
utilizado, pero de una forma mucho más limitada.
Las vacunas pediátricas que incluyen un adyuvante de aluminio son
una medida indirecta de la exposición infantil al aluminio y su uso
creciente se ha correlacionado directamente con el aumento de la
prevalencia de TEA [11]. Los
modelos animales de TEA siguen apoyando la relación entre el
aluminio y los adyuvantes de aluminio utilizados en la vacunación
humana en particular [12].
Hasta ahora no hay datos previos de la presencia de aluminio en el
tejido cerebral de donantes que muriesen con un diagnóstico de TEA.
Hemos medido el aluminio en el tejido cerebral de las pacientes con
autismo e identificado la ubicación del aluminio en esos tejidos.
2.-
Materiales
y métodos
[…]
3.-
Resultados
3.1.
Contenido de aluminio de los tejidos cerebrales
El
contenido de aluminio de todos los tejidos osciló entre 0.01 (límite
de cuantificación) y 22,11 μg/g de peso seco (Tabla
1).
El
contenido de aluminio para cerebros enteros (n= 4 ó 5, dependiendo
de la disponibilidad de tejido del hipocampo) osciló entre 1,20
(1,06) μg/g
de
peso seco, para una donante femenina de 44 años (A1) hasta 4,77
(4,79) μg/g
de
peso seco, para un donante de 33 años (A5). Las mediciones previas
de la presencia de aluminio en el cerebro, incluyendo nuestro
estudio
de 60 cerebros [13], nos ha permitido definir categorías de
contenido de aluminio en el cerebro a partir de ≤
de 1,0
de
peso seco como patológicamente benigno (a diferencia del normal).
Aproximadamente el 40% de los tejidos (24/59) presentaban un
contenido de aluminio considerado patológicamente preocupante (≥
2,00 μg/g
de
peso seco), mientras que aproximadamente el 67% de estos tejidos
presentaban un contenido de aluminio considerado patológicamente
significativo (≥ 3,00 μg/g
de
peso seco). Los
cerebros de los 5 individuos tenían al menos un tejido con un
contenido de aluminio patológicamente significativo. Los cerebros de
4 individuos tenían al menos un tejido con un contenido de aluminio
de 5,00 μg/g
de
peso seco, mientras que 3 de ellos tenían por lo menos un tejido
con un contenido en aluminio de 10,oo μg/g
de
peso seco (Tabla
1).
El
contenido medio de aluminio (SD) en los 5 pacientes para cada lóbulo
fue de 3,82 (5,42), 2,30 (2,00), 2,79 (4,05 y 3,82 (5,17) μg/g
de
peso seco, para los lóbulos occipital, frontal, temporal y parietal
respectivamente. No
hubo diferencias estadísticamente significativas en el contenido de
aluminio entre los 4 lóbulos.
3.2.- Fluorescencia de aluminio en los tejidos cerebrales
3.2.- Fluorescencia de aluminio en los tejidos cerebrales
Examinamos
las secciones de los tejidos cerebrales de 10 individuos (3 hombres y
7 mujeres) que murieron y que estaban diagnosticados con TEA y
registramos la presencia de aluminio en estos tejidos (Tabla S1. Ver
artículo original). La excitación del complejo de aluminio y la
tinción de lumagallion emite una fluorescencia anaranjada
característica que aparece cada vez con una mayor intensidad de
amarillo brillante a medida que la intensidad de la fluorescencia es
mayor. El aluminio, identificado como depósitos reactivos de la
tinción de lumogallion, se registró en al menos un tejido de los 10
individuos. La autofluorescencia de las secciones de tejidos
adyacentes confirmó la fluorescencia de la tinción de lumogallion
como un indicativo de la presencia de aluminio. Los depósitos de
aluminio eran más frecuentes en los hombres (129 en 7 individuos)
que en las mujeres (21 en 3 individuos). El aluminio se encontró
tanto en la materia blanca (62 depósitos) con la gris (88
depósitos). En las mujeres, la mayoría de los depósitos se
identificaron como extracelulares (15/21), mientras que en los
hombres ocurría lo contrario, con 80 de los 129 depósitos
intracelulares. Sólo se nos suministraron 3 secciones de cada
tejido, por lo que no pudimos realizar ninguna tinción para la
morfología general, lo que significaba que no siempre fue posible
determinar qué subtipo de célula mostraba fluorescencia de
aluminio.
Se
identificaron glóbulos blancos monocluares cargados de aluminio,
probablemente linfocitos, en las meninges y posiblemente en el lugar
de entrada del sistema linfático en el tejido cerebral (Figura 1).
El aluminio se podía ver claramente dentro de las células como
depósitos discretos o como una fluorescencia amarilla brillante. El
aluminio se localizó en células inflamatorias asociados a los vasos
sanguíneos (Figura 2). En un caso, se observó un linfocito o
monocito cargado de aluminio dentro de un lumen del vaso sanguíneo
rodeado de glóbulos rojos, mientras que otro probable linfocito que
muestra fluorescencia amarilla intensa se observó en la túnica
adventicia (Figura 2b). Se observaron con frecuencia células gliales
que incluían células similares a la microglía, que mostraban
fluorescencia positiva de aluminio en el tejido cerebral en las
cercanías de los depósitos extracelulares teñidos con aluminio
(Figuras 3 y 4). Los depósitos discretos de aluminio de
aproximadamente 1 μm de diámetro eran
visibles claramente en los cuerpos de células gliales redondas y
células similares a la glía, y a menudo en las cercanías o
localizadas con lipofuscina (Fig. 5). La microscopía de
fluorescencia selectiva de aluminio fue capaz de identificar aluminio
en ubicaciones extracelulares e intracelulares en neuronas y células
no neuronales y el todos los tejidos cerebrales estudiados (Figura
1-5). El método sólo identifica el aluminio al observar las grandes
áreas de tejido cerebral sin ninguna fluorescencia positiva
característica del
aluminio (Fig. S1).
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Figura
1. Células inflamatorias mononucleares (probablemente linfocitos) en
membranas leptomeníngeas en el hipocampo y el lóbulo frontal de un
donante varón de 50 años (A2), diagnosticado con autismo. El
aluminio reactivo a la tintura de lumogallion intracelular se observó
a través de la emisión de fluorescencia naranja (flechas blancas)
en el hipocampo (a) y el lóbulo frontal (b). Se detectó una emisión
de autofluorescencia verde en la sección adyacente no teñida ( (5
μm) (c y d). Los paneles superior e inferior representan inserciones
agrandadas marcadas con asteriscos, del canal de fluorescencia y de
la superposición de campo brillante. Aumento x 400; barra graduada:
50 μm. (Para la interpretación del color en estas figuras, se
remite al lector a la versión web de este artículo).
Figura 2. Aluminio reactivo a la tintura de lumogallion
intracelular en los vasos sanguíneos del hipocampo de un donante
masculino de 50 años (A2), diagnosticado con autismo. Se destacan
las células inflamatorias cargadas de aluminio que se observan en el
hipocampo en la pared del vaso (flecha blanca) (a) y que representan
fluorescencia naranja en el lumen (b). También se observó una
célula inflamatoria en la túnica adventicia del vaso (flecha
blanca) (b). El aluminio reactivo con tintura de Lumugallion se
identificó a través de una emisión de fluorescencia naranja ( a &
b) frente a una emisión de autofluorescencia verde (c & d) de la
sección adyacente no teñida (5 μm). Los paneles
superior e inferior representan inserciones aumentados marcadas con
asteriscos, del canal de fluorescencia y de la superposición de
campo brillante. Aumento
x 400; barra graduada: 50 μm. (Para la interpretación del color en
estas figuras, se remite al lector a la versión web de este
artículo).
Figura
3. Aluminio
intracelular en células en células morfológicamente compatibles
con glía o neuronas en el hipocampo de un donante masculino de 15
años (A4), diagnosticado con autismo. El aluminio celular reactivo
de tintura de Lumogallion identificado dentro de las células
parecidas a glía en el hipocampo (a) y produciendo una fluorescencia
anaranjada en la glía que rodea una probable célula neuronal dentro
del lóbulo parietal (b) que se resalta (flechas blancas). El
aluminio reactivo con tintura de Lumogallion se identificó a través
de una emisión de fluorescencia naranja (a & b) frente a la
emisión de autofluorescencia verde (c & d) de la subsecuente
sección no teñida (5 μm) (flecha blanca / asterisco). Los
paneles superior e inferior representan inserciones aumentadas
marcadas con asteriscos, del canal de fluorescencia y de la
superposición de campo brillante. Aumento
x 400; barra graduada: 50 μm. (Para la interpretación del color en
estas figuras, se remite al lector a la versión web de este
artículo).
Figura
4. Aluminio intracelular en células morfológicamente compatibles
con microglía dentro de los lóbulos parietal y temporal de los
donantes masculinas de 29 años (a8) y 15 años (A4), diagnosticados
con autismo. Se
observó la presencia de aluminio extracelular (flechas blancas) que
produce una emisión de fluorescencia naranja alrededor de las
probables células de microglía presentes en el lóbulo parietal
(a) y temporal (b) de los donantes A8 y A4 respectivamente. Las
secciones adyacentes (5 μm)no tintadas, produjeron una débil
emisión de autofluorescencia verde en la zona idéntica visualizada
la materia blanca (c) y en la materia gris (d) de los lóbulos
respectivos. Los
paneles superior e inferior representan inserciones aumentadas
marcadas con asteriscos, del canal de fluorescencia y de la
superposición de campo brillante. Aumento
x 400; barra graduada: 50 μm. (Para la interpretación del color en
estas figuras, se remite al lector a la versión web de este
artículo).
Figura
5. Aluminio con tintura de Lumogallion
en células neuronales y probablemente gliales en el lóbulo temporal
e hipocampo de un donante masculino de 14 años (A10), diagnosticado
con autismo. El aluminio intraneuronal en el lóbulo temporal (a) fue
identificado a través de una emisión de fluorescencia naranja,
junto con lipofuscina, según lo revelado por una fluorescencia
amarilla en la sección (c) de autofluorescencia no
tintada (5 μm).
La
fluorescencia intracelular naranja (flecha blanca) se observó en la
glía del hipocampo (b), produciendo una emisión de
autofluorescencia verde en la sección no teñida (d). Los
paneles superior e inferior representan inserciones aumentadas
marcadas con asteriscos, del canal de fluorescencia y de la
superposición de campo brillante. Aumento
x 400; barra graduada: 50 μm. (Para la interpretación del color en
estas figuras, se remite al lector a la versión web de este
artículo).
4.
Discusión
El
contenido en aluminio de los tejidos cerebrales de los pacientes
diagnosticados de TEA fue extremadamente alto (Tabla
1). Mientras que se observó una variabilidad significativa entre
los tejidos, entre los lóbulos y entre sujetos, el contenido medio
de aluminio en cada lóbulo de los cinco sujetos fue uno de los
mayores valores obtenidos de todas las mediciones históricas
anteriores del contenido de aluminio en el cerebro, incluyendo
trastornos iatrogénicos, como la encefalopatía por diálisis (13,
15, 16-19). Los 4 donantes masculinos tenían concentraciones
significativamente más altas de aluminio en el cerebro que la
donante femenina. Se registraron algunos de los valores más altos
del contenido en aluminio en el cerebro de los medidos en tejidos
sanos o enfermos de estos donantes masculinos con trastorno del
espectro autista, incluyendo valores de 17,10, 18,57 y 22,11 μg/g
de peso seco (Tabla 1). Lo que diferencia estos datos de otros
análisis para determinar la presencia de aluminio en el cerebro en
otras enfermedades es la edad de los donantes diagnosticados de TEA.
¿Por qué, por ejemplo, un muchacho de 15 años tenía un
contenido tan alto de aluminio en sus tejidos cerebrales?. No hay
datos comparativos en la literatura científica, siendo los más
cercanos los datos de un varón de 42 años con la enfermedad de
Alzheimer [19].
La
microscopía de fluorescencia selectiva de aluminio ha proporcionado
información sobre la ubicación del aluminio en estos tejidos
cerebrales de pacientes con TEA (Figuras 1-5). El aluminio se
encontró tanto en la sustancia blanca como en la sustancia gris y
tanto en una ubicación extra como intracelular. Estos valores fueron
muy destacados en estos tejidos de paciente con TEA. Las células que
morfológicamente parecían no neuronales y muy cargadas con aluminio
estaban asociadas con las meninges (Figura
1), los vasos sanguíneos (Figura
2) y dentro de la materia gris y blanca (Figuras 3-5). Algunas de
estas células parecían gliales (probablemente astrocitos), mientras
que otras tenían núcleos alargados que daban la apariencia de
microglía [5]. Estas últimas se observaron a veces en el entorno de
los depósitos de aluminio extracelular. Esto implica que el
aluminio, de alguna manera, cruzó la barrera hematoencefálica y fue
absorbido por una célula nativa, a saber, células de microglía.
Curiosamente, la presencia de células inflamatorias cargadas de
aluminio ocasionales en los vasos sanguíneos y en las leptomeninges,
abre la posibilidad de un modo de entrada del aluminio distinto en el
cerebro, es decir, intracelularmente. Sin embargo, para permitir que
este segundo escenario tenga importancia, sería de esperar algún
tipo de lesión intracerebral para permitir la salida de linfocitos y
monocitos de los vasos sanguíneos [20]. La identificación en este
estudio de células no neuronales que incluyen células
inflamatorias, células gliales y microglía cargadas de aluminio es
una observación destacada para los pacientes con TEA. Por
ejemplo, la mayoría de los depósitos de aluminio identificados en
el tejido cerebral de pacientes con TEA fueron extracelulares y casi
siempre asociados con la materia gris [19]. El aluminio es citotóxico
[21] y es poco probable que su asociación con células inflamatorias
en los vasos sanguíneos, las meninges y el sistema nervioso central
sea de carácter benigno. La microglía cargada de aluminio,
mientras permanece potencialmente viable, al menos durante algún
tiempo, se verá inevitablemente comprometida y se cree que la
disfunción de la microglía está relacionada con la etiología de
TEA [22], por ejemplo, en la alteración de la poda sináptica [23].
Además, la sugerencia de que puede entrar aluminio en el cerebro a
través de células del sistema inmune que circulan por la sangre y
la linfa y este proceso se acelera en pacientes con TEA podría
responder la pregunta planteada anteriormente de por qué había
tanto aluminio en el cerebro de un niño de 15 años con un trastorno
del espectro autista.
Una
limitación de nuestro estudio es el pequeño número de casos a los
que tuvimos acceso para estudiar y la disponibilidad limitada de
tejido. Con respecto a esto último, tener acceso a solo 1 g de
tejido congelado y solo 3 secciones de tejido fijado por lóbulo,
normalmente se entendería como una importante limitación.
Ciertamente, si no hubiéramos identificado depósitos significativos
de aluminio en una muestra tan pequeña (el cerebro promedio pesa
entre 1500 y 2000 g) de tejido cerebral, tal hallazgo podría
considerarse equívoco. Sin embargo, el hecho de que encontramos
aluminio en cada muestra del tejido cerebral, congelado o fijo,
sugiere de manera consistente que las personas diagnosticadas con TEA
tienen unos niveles extremadamente altos de aluminio en su tejido
cerebral y que este aluminio está especialmente asociado con células
no neuronales que incluyen microglía y otros monocitos
inflamatorios.
5.
Conclusiones
Hemos
realizado las primeras mediciones de la presencia de aluminio en el
tejido cerebral de pacientes con TEA y hemos demostrado que el
contenido de aluminio en los tejidos cerebrales es extremadamente
alto. Se ha identificado aluminio en el tejido cerebral tanto
extracelular como intracelularmente, involucrando en este caso a las
neuronas como a las células no neuronales. La presencia de aluminio
en las células inflamatorias de las meninges, los vasos sanguíneos,
la materia blanca y gris, es una observación destacada y podría
implicar al aluminio como origen del trastorno del espectro autista.
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Referencias:
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