La arquitectura viral del SARS-CoV-2 con el gancho postfusión
revelado por microscopía crioelectrónica
Por Chuang Liu, Yang
Yang, Yuanzhu Gao, Chenguang Shen, Bin Ju, Congcong Liu, Xian Tang,
Jinli Wei, Xiaomin Ma, Weilong Liu, Shuman Xu, Yingxia Liu, Jing
Yuan, Jing Wu, Zheng Liu, Zheng Zhang, Peiyi Wang, Lei Liu
Nota: Este
artículo es una publicación preliminar que todavía no ha pasado
una revisión de pares
Resumen
Desde
diciembre de 2019, el brote de la Enfermedad del Coronavirus 2019
(COVID-19) se propagó desde Wuhan, China, al mundo, y ha causado más
de 87.000 casos diagnosticados y más de 3.000 muertes en todo el
mundo. Para luchar contra COVID-19, llevamos a cabo una investigación
para el casi nativo SARS-CoV-2 y comunicamos aquí nuestros
resultados preliminares obtenidos. El patógeno de COVID-19, el
nativo SARS-CoV-2, fue aislado, amplificado y purificado en un
laboratorio de BSL-3. Toda la arquitectura viral del SARS-CoV-2 fue
examinada por microscopía electrónica de transmisión (tanto la
tinción negativa como la microscopía crioelectrónica, Cryo-EM).
Observamos que las partículas del virión son aproximadamente
esféricas o moderadamente pleiomórficas. Los ganchos tienen forma
de uña hacia el exterior con un cuerpo largo incrustado en la
envoltura. La morfología del virión observada indica que la
proteína S del SARS-CoV-2 está en estado de postfusión, con la S1
disociada. Este estado mostrado por primera vez por la microscopía
crioelectrónica podría proporcionar una información importante
para la identificación e investigación clínica relevante de este
nuevo coronavirus.
Introducción
Los
Coronavirus (CoV) son una gran familia de virus
zoonóticos que pueden ser transmitidos de animales a humanos y
causan enfermedades que van desde el resfriado común hasta
enfermedades graves [1], por ejemplo, el Síndrome Respiratorio de
Oriente Medio (MERS) [2] [3] y el Síndrome Respiratorio Agudo Severo
(SARS) [4] en el ser humano. Desde principios de diciembre de 2019,
el brote de una epidemia desconocida de neumonía en Wuhan, una
ciudad en la provincia de Hubei, China, se identifica como causada
por un nuevo coronavirus [5], nombrado como SARS-CoV-2 por el Comité
Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) y la enfermedad fue
nombrada como Enfermedad Coronavirus 2019 (COVID-19) por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) [6]. Hasta ahora, se han
notificado casi 80.000 casos confirmados y más de 2.800 muertes en
China (del sitio web de la OMS). Muchos otros países de todo el
mundo también han notificado un rápido aumento del número de
casos. El mundo se enfrenta ahora a una gran amenaza de COVID-19 [7].
Mientras que el mundo está aunando esfuerzos para desarrollar
diagnósticos, terapias y vacunas para luchar contra COVID-19, se
necesita urgentemente información sobre el cultivo, la purificación
y la estructura supermolecular del SARS-CoV-2 en su estado nativo.
Los
CoV son Virus ARN monocatenarios positivos. En los últimos decenios
se ha avanzado en el conocimiento general de la estructura
supermolecular de los viriones mediante la determinación de varios
tipos de CoV utilizando el microscopio electrónico y la
cristalografía de rayos X. Los coronavirus tienen viriones esféricos
o moderadamente pleiomórficos. El diámetro del virión varía entre
80 nm y 120 nm. El ácido nucleico y la proteína de la nucleocápside
de los coronavirus están fuertemente comprimidos en el virión. La
superficie del virión es una bicapa lipídica tomada de la célula
huésped, en la que se encuentran varias proteínas de estructura de
gran importancia, incluyendo la proteína de espiga (S), la proteína
de envoltura (E) y la proteína de membrana (M) [8]. La proteína S,
que incluye la subunidad S1 y la subunidad S2, se considera la
proteína más importante del CoV. La subunidad S1 facilita la unión
a las células del huésped y la subunidad S2 participa en la
posterior fusión del virus y la membrana del huésped [9]. Varios
estudios recientes que consideraban la estructura del SARS-CoV-2 se
centraron en la proteína S. Wrapp y al. [10] informaron de una
estructura con una resolución de 3,5 Å de la proteína S del
SARS-CoV-2. Yan y al. [11] informaron de la compleja estructura de la
proteína S del SARS-CoV-2 con la enzima convertidora de angiotensina
2 (ACE2) del receptor de unión a las células del huésped humano.
Lan y otros [12] informaron sobre la estructura cristalina de la
región del dominio de unión del receptor de la proteína SARS-CoV-2
S (RBD) con la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). Sin
embargo, todas las proteínas mencionadas anteriormente se obtienen
en el laboratorio mediante un sistema de expresión recombinante, no
a partir de un virus real, por lo que todavía falta la estructura en
su conjunto del virión.
Además,
la seguridad es uno de los principales factores que restringen el
estudio de los virus del SARS-CoV-2 debido al alto riesgo de su
posible transmisión, los virus vivos deben manipularse en el
laboratorio de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) o superior. Aquí
informamos del exitoso aislamiento y purificación del SARS-CoV-2 en
el laboratorio BSL-3 y revelamos toda la arquitectura viral del
SARS-CoV-2 por microscopía electrónica de transmisión (tanto la
tinción negativa como la microscopía crioelectrónica). Es la
primera vez que se obtiene una imagen del SARS-CoV-2, el patógeno
del COVID-19 mediante esta técnica.
Resultados
y discusión
Un
hombre de 62 años fue ingresado en nuestro hospital el 15 de enero
de 2020 con neumonía, y fue diagnosticado como COVID-19. Una
investigación epidemiológica también confirmó un registro de
viajes a Wuhan entre el 1 y el 14 de enero de este paciente, y los
síntomas comenzaron el 11 de enero de 2020, incluyendo fiebre y tos.
Los virus respiratorios comunes, incluidos el virus de la gripe A, el
virus de la gripe B, los adenovirus, el virus de la parainfluenza
humana y otros coronavirus humanos, dieron resultados negativos. Se
encontraron linfopenia, PCR elevada e IL-6 en el momento de la
admisión (Tabla S1). Las tomografías computarizadas mostraron
opacidades múltiples en vidrio esmerilado y en pulmones bilaterales
en la etapa inicial, y se produjo consolidación pulmonar durante la
hospitalización (Figura S1).
[https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2020/03/05/2020.03.02.972927/F4.medium.gif]
La
muestra de líquido de lavado broncoalveolar (BALF) se recogió y se
sometió a una secuenciación de última generación y el aislamiento
del virus se realizó en el laboratorio BSL-3 (nivel 3 de
bioseguridad). Se observaron efectos citopáticos típicos (CPE) a
los 4 días posteriores a la inoculación (dpi) en la célula Vero,
incluyendo redondeo celular, encogimiento, lisis y desprendimiento en
todas las monocapas celulares (Figura 1A). Los ARN virales se
pudieron detectar en el sobrenadante del cultivo celular utilizando
un kit comercial aprobado por la CFDA con valores bajos de Ct (Figura
1B). Las partículas purificadas del SARS-CoV-2 mostraron una
actividad de reacción específica a los plasmas convalecientes de
los pacientes infectados por el SARS-CoV-2 (Figura 1C) y a los
anticuerpos monoclonales humanos específicos contra el RBD de la
proteína S utilizando el ensayo ELISA (Figura 1D). Mientras tanto,
el virus también pudo ser detectado por inmunofluorescencia usando
el plasma del paciente (Figura 1E). La secuencia del genoma de este
virus se ha presentado a la Iniciativa Mundial para el Intercambio de
Datos sobre la Gripe Aviar (GISAID) con un número de acceso de
EPI_ISL_406594, y se ha designado como
"BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020". Los análisis
filogenéticos demostraron que los virus poseían una alta homología
con los otros aislados, y dos de los aislados más cercanos son
BetaCoV/Wuhan/IPBCAMS-WH-04/2019 de Wuhan y SARS-CoV-2/NTU01/2020/TWN
de Taiwán (Figura 1F).
[https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2020/03/05/2020.03.02.972927/F1.medium.gif]
En
las figuras 2 y 3 presentamos las observaciones mediante microscopía
electrónica del SARS-CoV-2, tanto por tinción negativa (Figura
2A-2E) como por microscopía crioelectrónica (Figura 3A-3F). Las
partículas del virión son aproximadamente esféricas o
moderadamente pleiomórficas, con diámetros que van de 80nm a 160nm.
Para la mayoría de los viriones, la periferia está bien definida y
envuelta por una bicapa lipídica, que se puede ver claramente en la
imagen por microscopía crioelectrónica. Muy por debajo de la bicapa
lipídica se encuentra la densidad condensada formada por el ácido
nucleico y la proteína nucleocápside del SARS-CoV-2. Aunque muchas
de las partículas perdieron el pico durante la purificación o la
desactivación, el 20%-30% de los viriones todavía tienen picos
alrededor de la envoltura.
[ Pinchar en las imágenes para obtener otras de mayor resolución]
A
diferencia de los picos reportados en el estudio anterior [5], los
picos en nuestras imágenes son mucho más delgados tanto en la
imagen de tinción negativa (Figura 2) como en la imagen de
microscopía crioelectrónica (Figura 3). Los picos aquí tienen
forma de uña con un cuerpo largo incrustado en la envoltura. El
ancho de la cabeza de los picos es de alrededor de 7 nm. La longitud
de toda la espiga es de alrededor de 23 nm. La proteína S de los
coronavirus consistía en subunidades S1 y S2. Cuando la subunidad S1
se disocia, la S2 experimenta un cambio de conformación,
extendiéndose de una forma comprimida a una forma de uña, llamada
estado postfusión. La forma de uña también fue observada por otros
investigadores [13] [14] [15]. El trabajo realizado por Song y otros
[15] dio un análisis detallado de la estructura de la proteína S2
utilizando la proteína recombinante. No sólo reportaron la
morfología de la proteína S2 en el estado postfusión, también
reconstruyeron un mapa 3D. La imagen promedio 2D (Figura 2E) y el
mapa 3D (Figura 2D) presentados en su documento [15], tienen un
resultado consistente con nuestra observación, tanto en las imágenes
de tinción negativa como en las imágenes de microscopía
crioelectrónica (mostradas en la Figura 2C y en la Figura 3E,3F).
[…]
Agradecimientos
Reconocemos
el trabajo y la contribución de todos los proveedores de salud del
Tercer Hospital de Shenzhen. Agradecemos sinceramente tanto al centro
Cryo-EM como al laboratorio BSL-3 del Segundo Hospital Afiliado,
Escuela de Medicina, en la Universidad del Sur de Ciencia y
Tecnología por proporcionar las instalaciones y el apoyo técnico.
También agradecemos a los profesores Dongfeng Gu y Mingzhao Xing por
sus valiosos consejos y por haber leído el manuscrito.
Este
estudio recibió la aprobación del Comité de Ética de la
Investigación del Tercer Hospital Popular de Shenzhen, China (número
de aprobación: 2020-038). El Comité de Ética de la Investigación
renunció al requisito del consentimiento informado antes de que se
iniciara el estudio debido a la urgente necesidad de reunir datos
epidemiológicos y clínicos. Analizamos todos los datos de forma
anónima.
Referencias:
En
artículo original
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